AMG 176/吉列替尼（Gilteritinib） 组合显示 FLT3-ITD+ AML 的临床前活性

       根据虚拟AACR 年度会议期间提出的早期研究结果，发现选择性 MCL-1 抑制剂 AMG 176 加吉列替尼(Xospata) 的组合可协同靶向FLT3内部串联重复 (ITD) 突变的急性髓系白血病 (AML) 的临床前模型2021 年会议。

       具体而言，数据显示在接受该组合的2 个FLT3- ITD 突变 AML 细胞系中报告了强烈的协同效应，组合指数 <0.3 。此外，AMG 176 加 吉列替尼导致体外 MCL-1 和 BCL-2 样蛋白 11 (BIM) 表达增加，BIM/MCL-1 相互作用减少，细胞凋亡显着增加。在接受联合治疗的小鼠 (n = 10) 中，在肿瘤植入后 22 天报告了 92.8% 的肿瘤消退，其中 50% 的小鼠没有肿瘤。单独接受吉列替尼的小鼠在肿瘤植入后22天的肿瘤生长抑制率为73.9%，单独接受AMG 176的小鼠为76.1%。

    “我们的结果表明，AMG 176 加吉利替尼治疗在 AML 小鼠模型中有效且耐受性良好，这支持在临床环境中进行进一步评估，”AMG 开发者安进肿瘤学研究博士后研究员陈晓月176，共同调查员在会议期间展示的海报中写道。

       AML 患者的 5 年生存率为 25%，FLT3是恶性肿瘤中最常见的突变基因。大约25％的患者有此异常港8％FLT3 -ITD突变和FLT3酪氨酸激酶分别域突变。

       吉列替尼是一种有效的选择性口服 FLT3 抑制剂，目前已被 FDA 批准用于治疗FLT3 突变阳性复发/难治性 AML成人患者 。该批准基于 ADMIRAL 3 期研究 (NCT02421939) 的数据，其中使用吉列替尼的完全缓解 (CR) 或部分血液学恢复的 CR 率为 21%（n = 29；95% CI，14.5-28.8）中位随访时间为 4.6 个月。然而，需要联合治疗来克服FLT3突变的 AML患者对吉列替尼的耐药性。

       此外，研究作者表示FLT3突变具有抗细胞凋亡作用，MCL-1 是一种抗细胞凋亡蛋白，据说在 AML 细胞存活和耐药性中起关键作用，通常在 AML 中表达。AMG 176 被定义为一种高效且选择性的 MCL-1 抑制剂，可在 AML 中快速诱导细胞凋亡。在临床前研究中，研究人员测量了 AMG 176 加吉列替尼的组合指数，进行了免疫印迹实验，进行了逆转录 (RT)-聚合酶链反应 (PCR) 测定，MCL-1:BIM 复合免疫测定，评估了共免疫沉淀，生成 BIM 敲除细胞系，并评估组合和体内 BAK 活性测试的体内功效。

       对于组合指数，MOLM 13 和 MV4-11 细胞以 1000 个细胞/孔在 100 μl 培养基中接种到 96 孔板中，细胞接受 EC70 浓度的 AMG 176 和 EC50、EC70 和 EC90 浓度的吉列替尼。在治疗后 72 小时通过 CellTiter-Glo 发光细胞活力测定分析细胞活力，并通过 Calcasyn 软件计算组合指数。在这里，研究人员注意到 AMG 176 在FLT3 -ITD-突变 AML 细胞系中与吉列替尼协同作用，并且发现 BIM 敲除显着降低了 AMG 176 和 吉列替尼之间的协同作用。

       在免疫印迹实验中，MOLM 13 和 MV4-11 细胞接受 20 nM吉列替尼2、4、8、16 或 24 小时。细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤，在冰上的放射免疫沉淀缓冲液中裂解，并通过在 4 摄氏度下离心预清除裂解物，然后进行 DCTM 蛋白质测定分析以确定蛋白质浓度。

       在 RT-PCR 检测中，MOLM 13 和 MV4-11 细胞接受二甲基亚砜 (DMSO)、250 nM AMG 176、20 nM吉列替尼或 20 nM吉列替尼和 250 nM AMG 176 持续 2 天。通过 RNeasy Kits 提取总 RNA，并通过 SYBR Green qPCR 测试 MCL-1、BCL-2 和甘油醛 3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) mRNA 水平。

       MCL-1 和 BCL-2 mRNA 水平通过 GAPDH mRNA 水平标准化，然后针对 DMSO 处理对照进行标准化。数据显示，单独接受吉列替尼或与 AMG 176 联合治疗的样本中 MCL-1 蛋白表达增加。此外，与 DMSO 对照相比，联合治疗样本中 MCL-1 螯合 BIM 的部分显着降低（P <.05） .

       此外，在临床前模型中，发现吉列替尼增加了 BIM 表达，并且在用 FLT3 抑制剂治疗后，过表达的 BIM 蛋白被 MCL-1 和 BCL-2 隔离。用两种药物治疗后，BIM/MCL-1 复合物释放 BIM；然而，与吉列替尼单药治疗相比，AMG 176 加吉列替尼并没有增加 BCL-2 隔离的 BIM 量。在通过 CRISPR/Cas9 技术生成 BIM 敲除细胞系时，将 MV4-11 细胞送至 Synthego 进行工程化，并使用位于BCL2L11基因第二个外显子的 3-guide RNA，发现BCL2L11基因可以通过选择性剪接产生多种 BIM 同种型。

       对于组合的体内功效，将 5 x 106 MV4-11 细胞注射到雌性无胸腺裸鼠中。肿瘤植入后 12 天，将小鼠随机分为 4 组，每组 10 只。AMG 176 以 30 mg/kg 的剂量给药，给药 2 天/5 天，持续 2 周；吉列替尼以每天 3 mg/kg 的剂量给药。每周两次测量小鼠体重和胁腹肿瘤大小。对于体内 BAK 活性，学生的 t 检验值如下：媒介物与 AMG 176 ( P = .0010)、媒介物与吉列替尼( P = .2825)、媒介物与组合 ( P = .0178)、 AMG 176与组合 ( P = .2504) 和吉列替尼与组合 ( P = .0157)。两组间未观察到体重显着下降。

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