使用细胞培养和蛋白质提取进行曲美替尼治疗

　　曲美替尼是丝裂原激活细胞外信号调控激酶1(MEK1)和MEK2激酶活性的可逆性抑制剂。

　　MEK蛋白是细胞外信号相关激酶(ERK)途径的上游调节因子，能促进细胞增殖。

　　曲美替尼可通过抑制MEK抑制BRAFV600突变阳性癌细胞的生长。

　　来自单一供体的原代人成年肾成纤维细胞获自Cambridge Bioscience，并在含有生长补充剂(Cambridge Bioscience)的I-GRO培养基中培养。

　　对于急性(长达30分钟)TGF- β1刺激，如前所述，将细胞(约100,000个)在生理学无血清缓冲液中进行血清饥饿1小时。在长期研究(24小时)的刺激，成纤维细胞在完全培养基包括血清和生长补充剂。

　　在TGF- β1刺激(5 ng / ml)之前，将成纤维细胞与曲美替尼(10或20 nM)或溶媒预孵育30分钟。

　　如前所述，在实验结束时，将成纤维细胞溶解并储存在-80°C下直至进一步使用。

　　如前所述，使用NuPAGE电泳和缓冲液系统(Invitrogen)对肾脏样品或成纤维细胞裂解物进行免疫印迹分析。蛋白通过ECL总理(GE Healthcare)的可视化。使用ImageJ 1.46r(美国国立卫生研究院)确定关注频段的光密度，并针对适当的加载控件进行归一化。

　　将归一化的对照样品的值任意设置为1。使用Restore Plus试剂(Fisher Scientific)剥离膜，并再次检测微管蛋白，β-肌动蛋白，总ERK1 / 2，总STAT3或总P65。

　　由于技术原因，根据平行蛋白质印迹法估算了总S6和总AKT。

　　将人肾成纤维细胞以每孔3×10 3个细胞的密度接种在96孔板(Nunc)的完全培养基中。第二天，加入新鲜培养基以及指定浓度的曲美替尼或媒介物。

　　孵育30分钟后，将5 ng / mlTGF- β1加入相应的孔中。培养24或48小时后，根据制造商的说明用MTT测定法(Promega)定量每个孔中的活细胞数。

　　每种条件进行三次重复测定，并将实验重复三次。针对24小时未刺激(无TGF- β1)对照样品的吸光度，将所有数据标准化。