丙肝达卡他韦的药物活性有效成分

　　达拉他韦(Daclatasvir)是第一个抗丙肝病毒的NS5A抑制剂，2014年和2015年先后在日本、欧洲和美国获批用于治疗丙肝病毒感染。2017年4月终于在我国获得批准。

　　要想了解达拉他韦，首先要知道什么是NS5A抑制剂?丙肝病毒在肝细胞里复制的过程中，会产生两类蛋白质：一类被称为“结构蛋白”。顾名思义，“结构蛋白”是成熟病毒的组成结构或成分，如病毒核心蛋白、病毒包膜蛋白等。另一类被称为“非结构蛋白”，也就是这类蛋白质不属于成熟病毒的组成结构或成分。

　　施贵宝公司发现新型的抗丙肝药物，应用高通量筛选方法先后筛选了近一百万个化合物。当然，这么大规模的筛选是因为有了丙肝复制子细胞模型，可以筛选出丙肝特异性抑制剂，后来就发现了BMS-858 (Fig1)。BMS-858抑制丙肝活性EC50仅在0.57μM~1.0μM，细胞毒性CC50> 50μM，虽然不理想，但是作为先导化合物已经足够了，于是药理学家和药物化学家们就忙起来了。

　　达卡他韦是通过抑制丙肝的NS5A而发挥作用，但是在当时，NS5A蛋白可以做为抗丙肝的靶点并不为人所知。在当时，NS3A和NS5B这两个靶点是抗丙肝的已知的热门靶点，药理学家最初以为BMS-858是这两个靶点的抑制剂。然而，实验表明BMS-858对NS3A和NS5B无抑制作用，当时药理学家们就激动了，因为BMS-858可能作用新靶点啊!怎么找到BMS-858的作用靶点呢?药理学家经过多轮筛选，找到了对BMS-858耐药的细胞，经过分析发现是位于NS5A的氨基酸Tyr93发生了变化，而这些Tyr93发生变化的细胞对NS3A和NS5B抑制剂仍然敏感，这一定程度上说明BMS-858作用于NS5A蛋白这个之前未被关注的靶点起到抗丙肝作用。后来又以BMS-858的类似化合物BMS-824为工具化合物进行了验证，于是，找到了全新的抗丙肝靶点NS5A蛋白。

　　药物化学家们对BMS-858研究时发现BMS-858这类结构在一些溶剂和复制子筛选介质中均不稳定，最初发现BMS-858不稳定是因为在进行活性测试前测了一下已经配好的BMS-858 DMSO溶液，结果发现BMS-858已经变质了!同样的，具有相同母核结构的BMS-824 (Fig1)也不稳定。科学家们冷静的考虑到，既然化合物BMS-824也在复制子筛选用的介质中不稳定，那么它为什么会显示出~10nM的EC50?是分解之前产生的活性呢，还是分解后产生的物质具有活性?若是后者，肯定会发现具有新颖母核的化合物!于是，科学家开始进行实验研究。首先，将BMS-824在不含细胞的培养基中孵育72h，然后将含有化合物的培养基用乙腈提取，HPLC测定，结果发现，检测不到BMS-824的存在了，这充分说明BMS-824在培养基中已经分解。将HPLC中检测到的A和B两个物质进行分离。

　　A和B竟然没有明显的抗病毒活性!那么问题就来了，之前监测到的抗病毒活性是什么物质产生的呢?反思一下实验过程：将化合物放进培养基里面处理后仍有活性 - HPLC显示无母体化合物，但有两个主要物质 - 分离出的主要物质无活性。反思后应该可以想到只有一种可能，那就是有活性的物质没被分离出来!为什么没被分离出来呢?要么含量太少检测不到，要么没有仪器检测器可检测到的信号。为了找到活性物质都去哪了，研究人员将HPLC的流出液分段收集后浓缩测定活性，结果发现活性物质UV吸收非常弱，几乎和基线差不多高度，这说明活性物质的含量很少，但化合物活性很高。

　　为了分离鉴定出真正的活性物质，研究者将大量的BMS-824用培养基进行处理，最后分离得到了活性成分，经过结构鉴定为BMS-824的二聚物化合物C (Fig2)。

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