布加替尼克服EGFR三重突变体的耐药性

　　布加替尼与抗EGFR单克隆抗体结合，克服对osimertinib的耐药性

　　据报道，如果与EGFR抗体西妥昔单抗一起使用，可以使用独特的变构抑制剂来治疗对osimertinib的抗性。最后，EGFR抑制剂布加替尼与抗EGFR抗体西妥昔单抗的组合显示出治疗异种移植物荷瘤小鼠中EGFR突变病例的令人满意的结果。西妥昔单抗还降低了布丽他尼的IC 50值。

　　EGFR-C797S / T790M /激活突变的耐药性

　　目前，在临床环境中有四种EGFR-TKI可用 - 吉非替尼，厄洛替尼，阿法替尼和osimertinib。吉非替尼和厄洛替尼是所谓的第一代EGFR-TKIs，被证明对携带EGFR突变的NSCLC有效(EGFR激活突变;外显子21缺失[del19]或外显子21中的L858R点突变[L858R])。Afatinib是第二代EGFR-TKI，不可逆地靶向泛HER信号通路。Osimertinib和EGF-816是与EGFR共价结合的第三代EGFR-TKI，可有效对抗T790M突变的EGFR，这是对第一代EGFR-TKI获得性耐药的最常见机制。除临床试验外，EGF-816尚不可获得。所有类别的EGFR-TKI都对单独的EGFR激活突变具有活性。

　　CellTiter-Glo测定显示，吉非替尼和阿法替尼对EGFR激活突变有效，如前所述，并且还有效对抗C797S的双突变，C797S是第二代和第三代EGFR-TKI的共价结合位点。 。然而，它们不再有效对抗T790M看门人突变，这是对第一代EGFR-TKIs最具抵抗力的机制。Osimertinib和EGF-816不仅对单独的EGFR激活突变有效，而且在体外对T790M的双突变也有效。尽管第三代EGFR-TKI显示T790M突变导致的耐药性被克服，但当C797S突变与顺式 T790M同时发生时，它们失去了抑制活性。表达三重突变EGFR的Ba / F3细胞对所有代的EGFR-TKI具有完全抗性，其IC 50值与亲本Ba / F3细胞相似。我们检测了PC9细胞(亲本;单独表达del19)和抗性PC9细胞(T790M;双突变del19与T790M，三重突变体;通过引入C797S / T790M / del19(triple-del19)突变体EGFR产生)对EGFR的敏感性-TKIs确认Ba / F3细胞中显示的特征。CellTiter-Glo测定揭示了PC9三重突变细胞中的类似结果，其对Ba / F3细胞中所见的所有EGFR-TKI也是难治的。有趣的是，PC9三重突变细胞对吉非替尼和osimertinib的联合治疗没有显示出敏感性，这种联合治疗显示克服了反式 C797S和T790M突变介导的获得性奥西替尼耐药。这些结果表明没有临床有益的药物可用于治疗三重突变EGFR。

　　布加替尼克服了EGFR三重突变体的耐药性

　　为了研究能够克服三重突变EGFR的候选者，我们使用CellTiter-Glo测定进行了重点药物筛选以检查它们对Ba / F3细胞中每种类型的EGFR-del19突变的功效。在重点药物筛选中使用的30种药物不仅包括EGFR-TKIs，还包括靶向其他酪氨酸激酶或丝氨酸/苏氨酸激酶的激酶抑制剂，这些激酶现在可用于临床或正在临床试验中进行评估，参考Duong-Ly et的报告。al。该显示重新利用针对疾病相关或药物-抗性突变体激酶抑制剂的潜力。在TKIs中，预计只有布加替尼和ponatinib对EGFR-triple-del19具有抑制活性〜在100nM时50%的生长抑制。然而，通过CellTiter-Glo测定法评估的普纳替尼对三重del19的效力令人失望，其IC 50值与亲本Ba / F3细胞几乎相同。然后，我们使用CellTiter-Glo测定法评估了布加替尼在T790M / del19和三重del19突变的表达EGFR的Ba / F3细胞中与其他临床可用的EGFR-TKI相比的功效。该试验表明，只有溴化抑制素抑制表达三重del19突变的Ba / F3细胞的生长，IC 50低。添加IL-3作为原始的存活信号传导通路活化剂抵消了溴替卡尼的这种抑制作用。通过蛋白质印迹证实了布加替尼在三重del19中的效力，其显示EGFR及其下游信号传导途径的磷酸化降低，呈剂量依赖性，与afatinib和osimertinib不能抑制EGFR磷酸化相反。虽然布加替尼在单独表达EGFR-del19，T790M / del19或C797S / del19的Ba / F3细胞中对细胞生长抑制和EGFR信号通路均显示出可接受的抑制活性，但其效力仅优于osimertinib对抗C797S / del19。在表达由L858R激活的突变EGFR的Ba / F3细胞(单独的L858R，T790M / L858R，C797S / L858R和C797S / T790M / L858R(三重L858R))中使用相同的EGFR-TKI设置的细胞生长抑制测定和蛋白质印迹显示布加替尼在EGFR-L858R系列中也有效，但效力低于del19，在表达由del19激活的相应EGFR突变类型的Ba / F3细胞中观察到相似的功效模式。

　　布加替尼作为EGFR-C797S / T790M /活化突变(三重突变EGFR)抑制剂的鉴定

　　(a)在热图中显示了在具有或不具有T790M或C797S突变的表达四种类型的EGFR-del19的Ba / F3细胞中筛选30种药物的生长抑制活性的结果。用100nM所示抑制剂处理表达每种EGFR突变体的Ba / F3细胞。在药物处理72小时后，使用CellTiter-Glo测定法测量细胞活力。从每个值除以DMSO对照计算相对细胞活力。在这些抑制剂中，只有格列替尼和普纳替尼对三重突变体EGFR足够有效。AZD3463充当三重突变的弱抑制剂。(b)通过用吉非替尼，osimertinib和布加替尼处理的EGFR-C797S / T790M / del19(triple-del19)突变的Ba / F3细胞的CellTiter-Glo测定评估生长抑制。N = 3。结果表示为平均值±sd 。使用生长抑制测定法计算IC 50值。(c)表达三重del19的Ba / F3细胞中布利沙替尼显着抑制EGFR和下游信号的磷酸化，尽管afatinib和osimertinib并未抑制三重del19的所有EGFR信号传导。

　　为了评估布丽他尼是否通过ATP竞争作用于EGFR，并比较其在三重突变体EGFR和野生型EGFR之间的活性，使用ADP-Glo​​试剂盒进行体外激酶测定。该试验证实的激酶活性抑制曲线随着三重突变体和野生型EGFR中的ATP浓度而变化，表明溴替卡非竞争性地影响EGFR激酶结构域的ATP结合位点。通过计算10μMATP的IC 50值证实了百吉他汀对三重突变体EGFR的更高效力，其对于三重L858R比野生型低约 10倍。此外，与每种药物的IC 50值相比，布加替尼对没有EGFR突变的细胞系的抑制活性低于阿法替尼和osimertinib ，特别是在野生型EGFR扩增的A431细胞中。在KRAS突变的A549或H460细胞中，所有这些抑制剂都具有高IC 50值。根据这些结果，与阿法替尼或甚至奥西替尼相比，预期布里替尼具有与野生型EGFR抑制相关的优选毒性特征)。

　　布加替尼通过ATP竞争抑制EGFR，对野生型EGFR或非EGFR突变细胞的效力较低

　　(a - c)使用ADP-Glo​​测定试剂盒评价布利他替在体外激酶测定中的抑制活性，根据(a)EGFR 中ATP浓度的增加，用溴替卡尼显示剂量依赖性的EGFR活性降低。-C797S / T790M / L858R或(b)野生型; N = 3。结果表示为平均值±sd(c)在10μM的ATP浓度下计算的IC 50值表明布利他替对EGFR-C797S / T790M / L858R的亲和力比对野生型EGFR的亲和力更好。(d)IC 50 使用CellTiter-Glo测定试剂盒评估的非EGFR突变细胞系A431，A549和H460的细胞活力测定计算的值用点图显示。

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